无菌室标准化规程与验收规范(含《洁净室沉降菌测试标准操作规程》)

1.目的

　　本规程旨在为无菌操作及无菌室的保护提供一个标准化规程。

2.适用范围

　　生测实验室

3.责任者

　　QC主管生测员

4.定义

　　无

5.安全注意事项

　　严格无菌操作，防止微生物污染；操作人员进入无菌室应先关掉紫外灯。

6.规程

　　6.1.无菌室应设有无菌操作间和缓冲间，无菌操作间洁净度应达到10000级，室内温度保持在20-24℃，湿度保持在45-60%。超净台洁净度应达到100级。

　　6.2.无菌室应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染。

　　6.3.严防一切灭菌器材和培养基污染，已污染者应停止使用。

　　6.4.无菌室应备有工作浓度的消毒液，如5％的甲酚溶液，70％的酒精，0.1％的新洁尔灭溶液，等等。

　　6.5.无菌室应定期用适宜的消毒液灭菌清洁，以保证无菌室的洁净度符合要求。

　　6.6.需要带入无菌室使用的仪器，器械，平皿等一切物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法灭菌。

　　6.7.工作人员进入无菌室前，必须用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换专用工作服，鞋，帽子，口罩和手套(或用70%的乙醇再次擦拭双手)，方可进入无菌室进行操作。

　　6.8.无菌室使用前必须打开无菌室的紫外灯辐照灭菌30分钟以上，并且同时打开超净台进行吹风。操作完毕，应及时清理无菌室，再用紫外灯辐照灭菌20分钟。

　　6.9.供试品在检查前，应保持外包装完整，不得开启，以防污染。检查前，用70％的酒精棉球消毒外表面。

　　6.10.每次操作过程中，均应做阴性对照，以检查无菌操作的可靠性。

　　6 .11.吸取菌液时，必须用吸耳球吸取，切勿直接用口接触吸管。

　　6.12.接种针每次使用前后，必须通过火焰灼烧灭菌，待冷却后，方可接种培养物。

　　6.13.带有菌液的吸管，试管，培养皿等器皿应浸泡在盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒，24小时后取出冲洗。

　　6.14.如有菌液洒在桌上或地上，应立即用5%石碳酸溶液或3％的来苏尔倾覆在被污染处至少30分钟，再做处理。工作衣帽等受到菌液污染时，应立即脱去，高压蒸汽灭菌后洗涤。

　　6.15.凡带有活菌的物品，必须经消毒后，才能在水龙头下冲洗，严禁污染下水道。

　　6.16.无菌室应每月检查菌落数。在超净工作台开启的状态下，取内径90mm的无菌培养皿若干，无菌操作分别注入融化并冷却至约45℃的营养琼脂培养基约15ml，放至凝固后，倒置于30～35℃培养箱培养48小时，证明无菌后，取平板3～5个，分别放置工作位置的左中右等处，开盖暴露30分钟后，倒置于30～35℃培养箱培养48小时，取出检查。100级洁净区平板杂菌数平均不得超过1个菌落，10000级洁净室平均不得超过3个菌落。如超过限度，应对无菌室进行彻底消毒，直至重复检查合乎要求为止。

7.参照

　　参照《药品卫生检验方法》 《中国药品检验标准操作规范》中(无菌检查法)章节 中华人民共和国医药行业标准YY/T0188.6-1995《药品检验操作规程》

8.分发部门

　　质量管理部

无菌室技术指导说明

　　在获得了无菌环境和无菌材料后，我们还要保持无菌状态，才能对某种特定的已知微生物进行研究或利用它们的功能，否则外界的各种微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的现象，在微生物学中我们叫做污染杂菌。防止污染是微生物学工作中十分关键的技术。一方面是彻底灭菌，另一方面防止污染，是无菌技术的两个方面。另外，我们还要防止所研究的微生物，特别是致病微生物或经过基因工程改造了的本来自然界不存在的微生物从我们的实验容器中逃逸到外界环境中去。为了这些目的，在微生物学中，有许多措施。

　　无菌室内的地面、墙壁必须平整，不易藏污纳垢，便于清洗。工作台的台面应该处于水平状态。无菌室和缓冲间都装有紫外线灯，无菌室的紫外线灯距离工作台面1米。工作人员进入无菌室应穿灭过菌的服装，戴帽子。

　　当前无菌室多存在于微生物工厂，一般实验室则使用超净台。超净台其主要功能是利用空气层流装置排除工作台面上部包括微生物在内的各种微小尘埃。通过电动装置使空气通过高效过滤器具后进入工作台面，使台面始终保持在流动无菌空气控制之下。而且在接近外部的一方有一道高速流动的气帘防止外部带菌空气进入。

　　在条件较困难的地方，也可以用木制无菌箱代替超净台。无菌箱结构简单，便于移动，箱正面开有两个洞，不操作时用推拉式小门挡住，操作时可以将双臂伸进去。正面上部装有玻璃，便于在内部操作，箱内部装有紫外线灯，从侧面小门可以放进去器具和菌种等。

应用

无菌操作技术当前不仅在微生物学研究和应用上起着举足轻重的作用，而且在许多生物技术中也被广泛应用。例如转基因技术、单克隆抗体技术等。

洁净室沉降菌测试标准操作规程

1目的：建立洁净室中沉降菌的测试标准操作规程，保证药品在规定洁净级别内进行生产。

2范围：洁净室的沉降菌的监测。

3依据：国家标准GB/T 16294-1996。

4职责：QA洁净度监测人员、微生物检验人员对本制度的实施负责。

5内容
5.1洁净室：对尘粒及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区域。

5.2洁净工作台：一种工作台或者与之类似的一个封闭围挡工作区。其特点是自身能够供给经过过滤的空气或气体，如垂直层流洁净罩、水平层流罩、垂直层流洁净工作台、水平层流洁净工作台、自净器等。

5.3洁净度：洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某一粒径悬浮粒子的允许统计数。

5.4菌落：细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU。通常用个数表示。

5.5测试方法
5.5.1方法概述：本测试方法利用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经48小时以上培养，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，来评定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室的洁净度。
5.5.2所用的仪器和设备
5.5.2.1高压消毒锅：使用时参照文件GZ-ZL-SOP-066-00进行操作。
5.5.2.2恒温培养箱：必须定期对培养箱的温度计进行检定。
5.5.2.3培养皿：一般采用中90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿。使用前将培养皿置于121℃湿热灭菌20分钟。
5.5.2.4培养基：普通营养琼脂培养基。将培养基加热熔化，冷却至约45℃在无菌操作条
件下将培养基注入培养皿，每皿约15m1。待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入30～35℃恒温培养箱中培养数小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用，制备好的培养基平皿应在2～8℃的环境中存放。
5.5.3测试步骤
5.5.3.1采样方法：将已制备好的培养皿放置在预先确定的取样点，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上盖后倒置。
5.5.3.2培养：全部采样结束，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。在30～35℃培养，时间不少于48小时。每批培养基应有对照试验，检查培养基本身是否污染，可每批选定3只培养皿作对照培养。
5.5.3.3菌落计数：用肉眼直接计数，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。

5.6注意事项
4.6.1测试用具要做灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
5.6.2采取一切措施防止人为对样本的污染。
5.6.3对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
5.6.4由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
5.6.5采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。

5.7测试规则
5.7.1测试状态
5.7.1.1沉降菌测试前：被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、必须控制在规定值内。被测试洁净室（区）已消毒。
5.7.1.2测试状态有静态和动态两种，并在报告中注明测试状态。
5.7.1.3测试人员：测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。静态测试时，室内测试人员不得多于2个人。
5.7.2测试时间
5.7.2.1对单向流，如100级净化房间内及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10分钟后开始。
5.7.2.2对非单向流，如10000级、100000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30分钟开始。

5.8沉降菌计数
5.8.1最少采样点数目：可按表1确定。在满足最少测点数的同时，还宜满足最少培养皿数，见表2。
表1最少采样点数目
面积(m2)           洁净度级别
            100  10000  100000  300000
＜10        2～3  2      2     2
≥10～＜20  4     2      2     2
≥20～＜40  8     2      2     2
≥40～＜100  16    4      2     2
≥100～＜200  40   10     3     3
注：表中的面积对于单向流洁净室是指送风面积，对于非单向流洁净室是指房间面积。
表2最少培养皿数
洁净度级别 所需Φ90mm培养皿数（以沉降0.5小时计）
  100             14
  10000            2
  100000           2
  300000           2
5.8.2采样点的布置：工作区测试点位置离地0.8～1.5m左右（略高于工作面）。可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点，采样点的布置应力求均匀，避免采样点在某 局部区域过于集中，某局部区域过于稀疏。
5.8.3记录：测试报告中应记录房间温度、相对湿度、压差、测试状态及测试数据。
5.8.4结果计算：用计数方法得出各个培养皿的菌落数。平均菌落数的计算见下式：
m1 m2 …… mn
平均菌落数m=n
式中：m为平均菌落数；m1为1号培养皿菌落数；m2为2号培养皿菌落数；mn为n号培养皿菌落数；n为培养皿总数。
5.8.5结果评定：用平均菌落数判断洁净室的空气中的微生物。
5.8.6洁净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准（见表3）。
5.8.7若某洁净室（区）的平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域先行消毒，然后重新测试两次，测试结果必须合格。
表3 
洁净级别     100级   10000级   100000级   300000级
标准（平均）  1个/皿  3个/皿    10个/皿    15个/皿